在现代生物医学研究中，基因敲除（Knockout, KO）细胞株已经成为一种不可或缺的工具。它们不仅在基础研究中发挥着重要作用，还在药物开发和疾病模型构建中有着广泛应用。本文将详细介绍KO细胞株的基础概念、应用领域以及操作指南。
什么是KO细胞株
KO细胞株是通过基因工程技术将特定基因敲除（即删除或失活）后得到的细胞株。基因敲除可以通过多种方法实现，如ZFN、TALENs、CRISPR等。通过敲除特定基因，研究人员可以研究该基因在细胞生理和病理过程中的功能。
KO细胞株的应用
1. 基础研究
KO细胞株在基础研究中被广泛应用于研究基因功能。通过比较野生型细胞和KO细胞的表型差异，研究人员可以揭示特定基因在细胞生长、分化、信号传导等过程中的作用。
例如，研究人员通过敲除p53基因，发现其在细胞周期调控和肿瘤抑制中的关键作用。通过对比p53 KO细胞和野生型细胞的生长曲线、细胞周期分布和凋亡率，揭示了p53在细胞应激反应中的功能。[1-2]
2. 疾病模型
KO细胞株可以用于构建疾病模型。例如，通过敲除与某种疾病相关的基因，可以模拟该疾病的细胞模型，从而为疾病机制研究和药物筛选提供平台。
例如，研究人员通过敲除APP基因，构建了阿尔茨海默病的细胞模型。通过对比APP KO细胞和野生型细胞的β-淀粉样蛋白积累情况，揭示了APP在阿尔茨海默病发病机制中的作用。[3-4]
3. 药物开发
在药物开发过程中，KO细胞株可以用于验证药物靶点的有效性和特异性。通过敲除药物靶点基因，可以评估药物对细胞的影响，从而筛选出更有效和安全的药物。
例如，研究人员通过敲除EGFR基因，对比了EGFR KO细胞和野生型细胞的药物敏感性，验证了EGFR作为抗癌药物靶点的有效性。[5]
4. 基因功能验证
KO细胞株还可以用于验证基因编辑工具的有效性。例如，通过CRISPR-Cas9技术敲除特定基因，可以验证该技术的编辑效率和特异性。
例如，研究人员将来自化脓链球菌的CRISPR核酸酶spCas9成功应用于哺乳动物细胞基因编辑，证明了RNA引导核酸酶技术的易于编程性和广泛适用性。[6]
致力于为基础研究、抗体验证、药物筛选、疾病诊断、治疗和检测等方面提供大力支持，赛业生物已建立成熟的Smart-CRISPR™细胞基因编辑平台和完善的细胞培养体系。
KO细胞株构建指南
目前应用较为广泛的是CRISPR/Cas9系统，其原理是利用gRNA特异性识别靶序列，引导Cas9核酸内切酶对靶序列的PAM上游进行切割，造成靶位点DNA双链断裂，再利用生物体自身的DNA损伤修复应答机制，将断裂上下游两端的序列连接，实现目标基因的敲除。
1. 设计sgRNA
首先，需要设计针对目标基因sgRNA。sgRNA的设计需要考虑特异性和有效性，可以使用在线工具如CRISPR Design Tool进行设计。
具体步骤
①选择目标基因：确定需要敲除的基因。
②设计sgRNA序列：使用在线工具（如Benchling、CRISPR Design Tool）设计针对目标基因的sgRNA序列。
③评估脱靶效应：选择脱靶效应较低的sgRNA序列，以提高编辑特异性。
2. sgRNA和Cas蛋白制备
①合成设计的sgRNA。
②制备Cas蛋白。
3. 转染细胞
将Ca9蛋白和sgRNA孵育，制备RNP复合物，取适量细胞与RNP复合物混匀后共同转移至电转杯中，选择合适的电转参数进行电转。电转完成后，将细胞接种至准备好的培养基中。 转染后48-72小时提取转染细胞基因组，进行PCR和测序分析gRNA切割效率。
4. 单克隆筛选
通过单细胞克隆化技术，将转染后的细胞进行单克隆筛选。常用的方法包括有限稀释法和流式细胞术。筛选出的单克隆细胞需要进行基因型鉴定，以确认目标基因是否成功敲除。
具体步骤
①有限稀释法：将转染后的细胞进行稀释，接种到96孔板中，每孔一个细胞。
②流式细胞术：使用流式细胞仪分选单个细胞，接种到96孔板中。
培养单克隆细胞：将单克隆细胞培养至足够数量。
③基因型鉴定：通过PCR和测序验证目标基因是否成功敲除。
5. 表型分析
最后，对获得的KO细胞株进行表型分析。可以通过Western blot、qPCR、免疫荧光等方法验证目标基因的敲除效果，并进行相关的功能研究。
具体步骤
①Western blot：检测目标蛋白的表达水平，验证基因敲除效果。
②qPCR：检测目标基因的mRNA表达水平，验证基因敲除效果。
③免疫荧光：观察目标蛋白在细胞中的定位和表达情况。
④其它各类功能研究：根据研究目的，进行细胞增殖、凋亡、迁移等功能实验。
你是否还想了解更多KO细胞构建的知识点，如：
基因敲除的sgRNA设计要注意哪些细节要点？
CRISPR-Cas9系统的活性检测方法有哪些？
针对细胞外或细胞内，检测脱靶的方法分别有哪些？
KO细胞的优势和挑战
KO细胞株作为一种强大的研究工具，在生物医学研究中具有广泛的应用前景。但KO细胞株构建过程较为繁琐，实验周期长，且容易出现敲除效果不彻底的情况，导致研究进度受阻。
优势
①高效性：现代基因编辑技术使得基因敲除变得更加高效和便捷。
②特异性：通过设计特异性的基因编辑工具，可以实现对目标基因的精确敲除。
③多功能性：基因敲除细胞不仅可以用于基础研究，还可以用于疾病模型构建和药物开发。
挑战
①脱靶效应：尽管现代基因编辑技术具有较高的特异性，但仍可能存在脱靶效应，导致非目标基因的编辑。
②细胞适应性：不同类型的细胞对基因编辑工具的适应性不同，可能需要优化转染条件。
③表型复杂性：基因敲除可能导致复杂的表型变化，需要进行全面的表型分析。
参考文献：
[1] Levine, A. J., & Oren, M. (2009). The first 30 years of p53: growing ever more complex. Nature Reviews Cancer, 9(10), 749-758. doi:10.1038/nrc2723
[2] Vousden, K. H., & Prives, C. (2009). Blinded by the Light: The Growing Complexity of p53. Cell, 137(3), 413-431. doi:10.1016/j.cell.2009.04.037
[3] Kwart, D., Paquet, D., Teo, S., Tessier-Lavigne, M., & Field, C. M. (2019). CRISPR-Cas9–mediated knockout of the Alzheimer’s disease risk gene SORL1 in human pluripotent stem cells leads to changes in APP processing and amyloid-β production. Stem Cell Reports, 12(3), 469-482. doi:10.1016/j.stemcr.2019.01.009
[4] Paquet, D., Kwart, D., Chen, A., Sproul, A., Jacob, S., Teo, S., ... & Tessier-Lavigne, M. (2016). Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9. Nature, 533(7601), 125-129. doi:10.1038/nature17664
[5]Soria, J. C., Ohe, Y., Vansteenkiste, J., Reungwetwattana, T., Chewaskulyong, B., Lee, K. H., ... & Ramalingam, S. S. (2018). Osimertinib in untreated EGFR-mutated advanced non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine, 378(2), 113-125. doi:10.1056/NEJMoa1713137
[6]Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., ... & Zhang, F. (2013). Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science, 339(6121), 819-823. doi:10.1126/science.1231143
本文摘自：https://www.cyagen.cn/articles/AE000591